Kolorimetrik Yöntemler: test materyalin UV absorbsiyonunun ölçülmesi veya bir belirteç ile reaksiyonu sonucu oluşan renkli bir bileşiğin görünür alanda spektral olarak belirlenmesine dayanır. Mikropalet okuyucu cihazlar birçok deneyle paralellik göstermektedir. Reaksiyon sonucu oluşan renk ve şiddetine göre hücre sayısı ve olayları yansımaktadır.

Kolorimetrik yöntemler aşağıdaki özellikleri yansıtmaktadır:

a.      Protein içerikleri (metilen mavisi, Coomassie blue, Kenacid blue,sülforhodaminB, Bichinoninic acid)

b.      RNA ve (akridin oranj) DNA içerikleri (Hoechst 33342) veya DNA sentezi (BrdU uptake)

c.      Lizozom ve Golgi cesimi aktivitesi (neutral red)

d.      Enzim aktivitesi (hexosaminidase, mitochondrial succinate dehydrogenase)

e.      Apoptozis: birçok anti kanser ilaç hücreleri apoptozisa uÄŸratır. Apoptozis tespitinde morfolojik inceleme, DNA incelemeleri, ve apoptozis olayında spesifk konumda bulunan amino asit tespitlerine dayanan özel yöntemler geliÅŸmiÅŸtir.

f.       Ãœreme (survival): yumuÅŸak agar ortamında veya ince tabakada üremenin karşılaÅŸtırılması. Ãœreme ile ilgili ipuçları saÄŸlamaktadır.

g.      Hücre populasiyonlarda ATP düzeyi canlılığın göstergesi olarak bilinir.

h.      Hücre proliferasiyonu, büyüme eÄŸrisi ve doublig time hesaplanması sitotoksisite ile ilgili testlerdir (Masters).

Akridin Oranj boyası ile DND ve RNA Ölçümü

RNA içeriğini ölçmek için kullanılan en yaygın boya Akridin Oranj (AO)’dır ve yapılan RNA çalışmalarının çoğunluğu AO’nun flüoresan özelliğine dayanır.

AO’nun özelliği, çift veya tek zincirli nükleik asitlere bağlandığı zaman absorbsiyonu ve emisyonunun değişiklik göstermesidir. AO, hücre içindeki tek zincirli nükleik asitleri kırmızıya, çift zincirli nükleik asitleri de (DNA ve kendi üstünde çifte sarmal yapmış RNA) yeşile boyamaktadır (Darzynkiewicz Z ve Simultaneous 1994; Darzynkiewicz Z 1976;Traganos F 1977). Hücre içi RNA’ların bir bölümünün tek zincirli olma özelliğinden yararlanılarak bu ölçümler yapılabilmektedir. AO’nun maksimum absorbsiyonu yaklaşık 455–490 nm’dir

Mitokondriyal aktiviteye dayalı MTT ölçümü

MTT ölçümü in vitro koÅŸullarda metabolizmanın canlılığına dayanarak sitotoksisiteyi ölçmek için uygulanan kantitatif kolorimetrik bir yöntemdir (Holst-Hansen ve Brünner, 1981). Bu yöntem, hızlı, kolay ve yüksek oranda doÄŸruluÄŸa sahiptir. Bir tetrazolyum tuzu olan MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür) sarı renkli olup, yaÅŸayan hücrelerin mitokondrilerinde bulunan süksinat-dehidrojenaz enzimine spesifik olarak baÄŸlanmaktadır. Bu baÄŸlanmanın sonunda suda çözünmeyen koyu mavi renkte kristaller oluÅŸmaktadır. Kristaller, DMSO ve izopropanol gibi organik çözücülerde kolayca çözünmektedir. Çözünmüş olan bu boya, konsantrasyona bağımlı olarak spektrofotometrik yöntemle görünür dalga boylarında ölçülebilen bir absorbans vermektedir. Böylece indirekt olarak hücrelerin metabolik aktiviteleri ölçmektedir. Ayrıca ölçülen deÄŸer yaÅŸayan hücre sayısı ile iliÅŸkilendirilmektedir (Mosmann, 1983; Deniot ve Lang, 1986; Carmichael, 1987).  Süksinatdehidrojenaz mitokondrilerin matriksinde yer alan Krebs siklusu enzimlerinden birisidir ve diÄŸer enzimlerinden farklı olarak mitokondryal iç membranın içe bakan yüzeyinde bulunmaktadır. Bu enzim, FAD (Flavin adenin dinükleotid) demir-kükürt (Fe:S) proteini içermektedir. (Murray ve ark., 1993; Voet ve Voet., 1995; Alberts ve ark., 1998). Bu yöntem, çalışma basamaklarının az olması açısından hızlı, kolay ve çok sayıda örneÄŸin çalışılmasına imkan veren bir testtir (Reile ve ark., 1990; Kueng ve ark., 1998; Senaratne ve ark., 2000).

MTT ölçümü

(0,5 mg/mL MTT) çalışma solüsyonu 96 kuyucuklu plaklara ilave edilir ve 3 saat inkübasyonda bekletildikten sonra plakalardaki hücrelerin optik dansiteleri ELISA cihazı ile 540 nm dalga boyunda okutulur (Mosmann, 1983;  Horakova, 2001).

Lizozomal aktiviteye dayalı nötral kırmızısı alım ölçümü

Kolorometrik bir yöntem olan nötral kırmızısı alımı sitotoksisite deneyi, lizozomlarda biriken, elektrostatik olarak lizozomal matriskteki anyonik bölgelere baÄŸlanan, katyonik süpravital bir boya olan nötral kırmızısının (3-amino-7-dimetilamino-2metil fenozin hidroklorid) canlı hücrelerce alımına dayanmaktadır (Bulychev ve ark., 1978; Weyermann ve ark., 2005; Andreoli ve ark., 2003). Hücre yüzeyinde veya hassas lizozomal membrandaki hasar, nötral kırmızısının alımını ve baÄŸlanmasını azaltarak canlı/saÄŸlam hücrelerle hasarlı/ölü hücreleri birbirinden ayırmayı mümkün kılmaktadır (Komissarova ve ark., 2004; Barile, 1994). Nötral kırmızısı boyası canlı, hasar görmemiÅŸ hücrelerin lizozomlarında birikmektedir (Fotakis ve Timbrell 2006;  Yano ve Marcondes, 2005). Nötral kırmızısı alımı sitotoksisite deneyi, oldukça basit, güvenilir ve diÄŸer pahalı deneylerin yerini alabilecek nitelikte bir test yöntemidir (Pipiolkiewicz ve ark., 2005).

Nötral kırmızısı alımı ölçümü

Test maddeleri ile gerekli süre bekletilen hücreler alıp besiyerleri uzaklaştırılmış ve hücreler 37^oC’ye getirilmiş fosfat tuz tamponu (PBS) ile yıkanır. Nötral kırmızısı çalışma solüsyonu ile 37^oC’de 3-4 saat inkübe edilir. Bu süre sonunda boyama solüsyonu uzaklaştırılarak taze hazırlanmış formaldehit-kalsiyum klorür fiksatif solüsyonu ile fikse edilir, plakalar ters çevrilerek kurutma kağıdı üzerinde bir gün bekletilerek kurutulur, asetik asit-etanol solüsyonu ile 15 dakika oda ısısında bekletilir ve 30 dakika çalkalayıcıda çalkalanarak boya homojen hale getirilmiştir. Plakalardaki hücrelerin optik dansiteleri ELISA cihazında 540 nm dalga boyunda okutulur. Bu deneyin her aşaması boya ışıkta bozulduğu için mümkün olduğunca karanlıkta yapılmalı (Horakova 2001, Shen ve West, 1998).

Nitrik Oksit

Son yapılan çalışmalarda Behçet hastalığı  romatoid artrit, oküler inflamasyon, atopik dermatit, psoriasis, SLE, diyabet gibi etyopatogenezinde immünolojik bozuklukların suçlandığ durumlarda NO deÄŸerlerinin yüksek bulunması, NO'nun immün sistemdeki inflamatuar ve sitotoksik özelliÄŸinin bir sonucu olarak bu hastalıkların ortaya çıkmasında önemli olduÄŸu belirtilmiÅŸtir.

NO kardiyovasküler, nörolojik, immunolojik ve diğer pek çok sistemde farklı rolleri olan biyolojik bir düzenleyicidir.

Damar düz kası üzerinde gevşetici etkisi yanında endotel ve sinir hücrelerinde haberci bir molekül, aktiflenmiş immün hücrelerde ise öldürücü bir molekül olarak görev yapar

Nitrik oksit (NO) biyolojik sistemlerde NO sentaz (NOS) enzimleri tarafından oluşturulur.
Bazik bir amino asit olan L-arjininden NO oluşumuna neden olan NOS enziminin nöronal NOS (nNOS, NOS I), endoteliyal NOS (eNOS, NOS III) ve iNOS (NOS II) olmak üzere üç farklı izoformu bulunur. nNOS ve eNOS yapısal enzimlerdir; iNOS ise çeşitli uyarılar ile indüklenebilmektedir. yNOS olarak da bilinen eNOS ve nNOS kalsiyum ve kalmoduline bağımlı, iNOS ise kalsiyum ve kalmodulinden bağımsız izoformlardır (Tunçtan, 2005., Şahan ve ark, 2001., Güray ve ark., 1997).

Nitrik oksit düzeyleri hakkında fikir veren nitrit ölçümü

NO yarılanma ömrü çok kısa olan bir bileÅŸiktir. Kan gibi fizyolojik ortamlarda yarılanma ömrü 6-20 saniye kadardır ve bu durum bazal koÅŸullarda NO ölçümünü güçleÅŸtirmektedir. NO, her ne kadar elektrokimyasal ve kemilüminesans gibi yöntemler ile direkt olarak ölçülebilse de, hızlı ve basit bir yöntem olarak çoÄŸu örnekte NO metabolizmasının dayanıklı son ürünleri olan nitrit (NO₂^-) ve nitrat (NO₃^-) miktarlarının ölçümü de sıklıkla kullanılmaktadır. Griess yöntemi ile duyarlılık limitinin 0,1-1 mM kadar olduÄŸu bildirilmiÅŸtir (Nagano, 1999). NO metabolizmasının incelenmesi için sadece nitrit miktarlarının ölçümü sıklıkla kullanılsada, bu reaksiyonlar sonucunda nitratın da oluÅŸtuÄŸu ve biyolojik sistemlerde nitritin hem demiri içeren proteinler varlığında nitrata okside olduÄŸu da unutulmamalıdır (Gross ve Wolin, 1995). Fizyolojik koÅŸullarda NO yaklaşık 3:2 oranında nitrit ve nitrata okside olmaktadır. Oksijenlenen çözeltilerde nitritin nitrata dönüşümü oldukça yavaÅŸtır. Bütün bunlarla birlikte, nitrit ve nitratın oluÅŸum oranları deÄŸiÅŸken ve örneÄŸe de bağımlı olduÄŸundan, NO metabolizmasının derecesinin en iyi göstergesi nitrit ve nitratın ikisinin birden (NOx olarak ifade edilir) ölçülmesiyle elde edilen sonuçlardır. Nitrit vücut sıvılarında nitrattan daha az konsantrasyonda bulunduÄŸundan, çoÄŸu durumda NOx nitrat konsantrasyonları ifade edilmektedir.

Nitrit ölçümü için 50’den fazla kolorimetrik yöntem kullanılmıştır; bu yöntemlerden çoğu azo boyalarının oluşumu temeline dayanmaktadır (Sawicki, 1971). Griess yöntemi nitritin asidik ortamda primer bir aromatik amin ile (sülfanilamit) diazotizasyonu ve N-(1-naftil) etilendiamin hidroklorit (NED) ile mor renkli bir azo ürünü oluşturması esasına dayanmaktadır (Tunçtan, 2005). Griess reaksiyonu, nitrit iyonlarına duyarlı olduğundan, ortamdaki nitratın nitrite indirgenmesi invivo olarak oluşan NO’nun gerçeğe yakın miktarlarda ölçümüne olanak tanımaktadır (Dejam ve ark., 2004). Diğer yandan, Griess yönteminin submikromolar düzeyde NO ölçümü için uygun olmadığı, ancak, nitrit ve birlikte bulunan nitroksitlerin ölçümü için en uygun ölçüm yöntemi olduğu da düşünülmektedir (Archer, 1993).

Griess yöntemi ile nitrit miktarlarının ölçülmesi

NO’in yarılanma ömrü çok kısa olduÄŸundan besiyerindeki oluÅŸan metaboliti NO₂¯ ölçülmektedir. Yukarıda belirtilen biçimde hazırlanan hücreleri içeren 96 kuyucuklu plakada her kuyucuktan 100 µL süpernatan alınıp üzerine eÅŸit miktardaGriess reaktifi (0,05% naftilendiamin dihidroklorür, 0,5% sülfonilamid, 2,5% H₃PO₄) ilave edilip 10 dakika oda sıcaklığında bekletildikten sonra ELISA cihazı ile 540 nm dalga boyunda okutulur (Al-alami ve ark. 1998). Elde edilen deÄŸerler kontrol grubunda standard olarak 5-25 µM sodium nitrit ile karşılaÅŸtırılır.

Kaynaklar

Alberts, B., Bray, D., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P., Essential Cell Biology, Garland Publishing Inc., New York,449, 121-129 (1998).

Al-alami O., Sammons, J., Martin, J.H., Hassan, H.T., Divergent effect of taxol on proliferation, apoptosis and nitric oxide production in MHH225 CD34 positive and U937 CD34 negative human leukaemia cells, Leuk. Res., 22, 939–945 (1998).

Andreoli, C., Gigante, D., Nuziata, A., A review of in vitro methods to assess the biological activity of tobocco smoke with the aim reducing the toxicity of smoke, Toxicol. in Vitro.,17, 587-594 (2003).

Archer, S., Measurment of nitric oxide in biological models, FASEB J., 7, 349-360 (1993).

Barile, F.A., Introduction to in vitro cytotoxicology mechanisms and methods, CRC Pres., Boca Raton, Florida, USA, 53-55 (1994).

Bulychev, A., Trouet, A., Tulkens, P., Uptake and intracellular distribution of neutral red in cultured fibroblasts, Cell Res., 115, 343-355 (1978).

Carmichael, J., Degraff, W. Gazdar., Minna, J.D., Mitchell, J.B., Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing, Cancer Res., 47, 936-942 (1987).

Darzynkiewicz Z. Simultaneous analysis of cellular RNA and DNA content, Methods in Cell Biology, Academic Press , Vol. 41: pp 401-420(1994),

Darzynkiewicz Z,Tragonos F,Sharpless T, Melamed MR. Lymphocyte stimulation: A rapid multiparameter analysis. Medical Sciences,73: 2881- 2884(1976).

Deniot, F., Lang, R., Rapid colorimetric assay for cell growth and survival modification to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability, J. Immunol. Meth., 89, 271-277 (1986).

Dejam, A., Hunter, C., Schechter, A.N., Gladwin, MT., Emerging role of nitrite in human biology, Blood Cells Mol Dis., 32 (3), 423-429 (2004).

Fotakis, G.,Timbrell, J.A., In vitro cytotoxicity assays: Comparision of  LDH, neutral red, MTT and protein assay in hepatoma cell lines following exposure to cadmium chloride, Toxicol. Lett., 160, 171-177 (2006).

Gross, S.S., Wolin, M.S., Nitric Oxide: Pathophysiological nechanisms, Annu. Rev. Physiol., 57, 737-769 (1995).

Güray, A., Samancı, N., Ovalı, F., Dadodlu, T., Nitrik Oksit: Fizyolojisi ve Klinik Önemi, T Klin J Med Sci, 17:115-119 (1997)

Horakova,  K., Sovcikova , A., Seemannova, Z., Syrova, D., Busanyova, K., Drobna, Z., Ferencik, M., Detection of  drug–induced, superoxide-mediated cell damage and its prevention by antioxidants, Free Radic. Biol. Med., 30: 650-664 (2001).

Komissarova, E., Saha, S.K., Rossman, T.G., Dead or dying: the importance of time in cytotoxicity assays using arsenite as an example, Toxicol. Appl. Pharmacol., 202, 99-107 (2005).

Kueng, W., Silber, E., Eppenberger, U., Quantification of cells cultured on 96-well plates, Anal. Biochem., 182, 16-19 (1989).

Masters Jonhn R.W., Animal cell culure 3. edition A practical approach edited by Johan R.W.Masters colorimetric assays 189-91

Mosmann, T., Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Meth., 65, 55-63 (1983).

Murray, R.K., Mayes, P.A., Granner, D.K., Rodwell, V.W. Kanser, Onkojenler ve Büyüme Faktörleri., Harper’in Biyokimyası., (Çeviri). Barış kitapevi,  Ä°stanbul, 818-836, (1993).

Nagano, T., Practical methods for detection of nitric oxide, Luminesence., 14, 283-290 (1999).

Popiolkiewicz, J., Polkowski, K., Skierski, J.S., Mazurek, A., In vitro toxicity evalution in the development of new anticancer drugs-genistein glycosides, Cancer Lett., 229, 67-75 (2005).

Reile, H., Birnbock, H., Bernhardt, G., Spruss, T., Schonenberger, H., Computerized determination of growth kinetic curves and doubling times from cells in microculture, Anal. Biochem., 187, 262-267 (1990).

Sawicki, C.R., Fluorometric Determination of Nitrate. Anal. Lett., 4, 761-775, (1971).

Shen, Y., West, C., Toxicity of aromatic aerobic biotransformation products of toluene to HeLa cells, Bull. Environ. Contam. Toxicol., 60(2), 177-184, (1998).

Senaratne, S.G., Pirianov, G., Mansi, J.L., Arnett, T.R., Colston, K.W., Biphosphonates induce apoptoses in human breast cancer cell lines, Br. J. Cancer., 82, 1459-1468 (2000).

Şahan, F., Özdemir, Ş., Karakuzu, A., Aktaş, A., Kızıltunç, A., Behçet hastalığında serum nitrik oksit seviyeleri, T Klin J Dermatol, 11:77-80 (2001)

Tunçtan, B.,  Nitrik oksit miktarlarının Griess yöntemi ile ölçülmesi. Türk Farmakoloji derneÄŸi Farmakoloji EÄŸitim Sempozyumları Programı Nitrik oksidin Farmakolojisi, 27 Mayıs, Mersin,61-68, (2005).

Traganos F, Darzynkiewicz Z, Sharpless T, Melamed MR. Simultaneous staining of ribonucleic and deoxyribonucleic acids in unfixed cells using acridine orange in a flow cytofluorometric system. J Histochem

Cytochem , 25: 46-56(1977).

Voet, D., Voet, J.G., Biochemestery. John Wiley and Sons, Inc., New York, 553-554, (1995).

Weyermann, J., Lochmann, D., Zimmer, A.,  A practical note on the use of cytotoxicity assays, Int. J. Pharm., 288, 369-376 (2005).

Yano, C.L., Marcondes, C.C.G., Cadmium chloride-induced oxidative stress in skeletal muscle cells in vitro, Free Radic. Biol. Med., 39 (10), 1378-1384 (2005).

Dr.Ecz. Nasratullah RESHÄ°DÄ°